Dna聚合酶3

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• • C—CHEMISTRY; METALLURGY
  • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
  • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
  • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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  • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract

本发明属于基因工程领域，公开了一种高保真DNA聚合酶、编码该高保真DNA聚合酶的基因，以及该高保真DNA聚合酶的制备方法，及其在核酸扩增中的应用。本发明公开的高保真DNA聚合酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。该高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。

Description

一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程领域，涉及一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用。

背景技术

[0002] DNA聚合酶广泛应用于分子生物学研究中，如DNA测序、标记、突变和核酸扩增等反 应。耐热DNA聚合酶由于其热稳定性，在核酸高温变性的条件下不会失活，是目前核酸扩增 的常用酶。根据序列的不同，DNA聚合酶可以分为六大族:A、B、C、D、X和Y，耐热DNA聚合酶主 要属于A族和B族，并具有相似的生物学性质。A族DNA聚合酶的代表是Taq DNA聚合酶，该聚 合酶分离自Thermus aquaticus YT-I的基因组，具有5 ’ -3 ’的DNA外切酶活性和5 ’ -3 ’ DNA聚 合酶活性，其菌株生长于75°C左右的温泉中，由于其能耐受高温变性，自发现后被广泛应用 于PCR反应，目前已被开发成多种试剂盒;后来的研究又从其他物种中分离出了多种A族DNA 聚合酶，但由于其不具有3’-5’的外切酶校正活性，容易在扩增时掺入错误的碱基，导致不 能忠实地扩增模板，直到B族DNA聚合酶的发现，才使得高保真地扩增模板成为可能。B族DNA 聚合酶主要分离自古细菌，包括广古菌、泉古菌、纳古菌和初古菌，其具有更高的热稳定性， 同时其3’-5’外切酶校正活性能识别错误掺入延伸链中的碱基，并将其切下，利用DNA聚合 酶活性添加为与模板互补的碱基，从而保证了新扩增链与模板的高度一致性。

[0003] 超嗜热古菌具有严格厌氧和超嗜热生长的特性，如Pyrodi ctium和Methanopyrus 属的物种能在110°c生长，而低于80°C则不能生长;从大西洋中脊3650米的超热烟囱中分离 的Pyrolobus fumarii是目前已知最耐热的古菌，其能在高达113°C的高温条件下增值，而 低于90°C则停止生长。目前已经从Pyrococcus和Thermococcus属中分离出了许多DNA聚合 酶，某些DNA聚合酶在极高的温度下仍能保持稳定，被应用于分子生物学研究，尤其是核酸 扩增中。其中，Pfu DNA聚合酶是一种来源于Pyrococcus furiosus的热稳定的DNA聚合酶， 具有5 ’ -3 ’ DNA聚合酶活性和3 ’ -5 ’的外切酶活性。由于Pfu DNA聚合酶有3 ’ -5 ’的外切酶活 性，因此在核酸扩增过程中出错的机率大大降低，保真性约为Taq DNA聚合酶的6倍。目前， Pfu DNA聚合酶通常作为首选的高保真DNA聚合酶，用于核酸的高保真扩增，但是，在实际应 用过程中，Pfu DNA聚合酶对引物和样品的结构、纯度和浓度要求比较高，反应灵敏度较低， 扩增效率较低，限制了Pfu DNA聚合酶的使用和推广。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高灵敏度、高扩增效率的高保真DNA聚合酶 及其制备和应用。

[0005] 为了实现本发明的目的，本发明采用如下的技术方案：

[0006] 本发明提供了一种高保真DNA聚合酶，命名为Tco DNA聚合酶，其具有（Ι)、（Π)所 示的氨基酸序列中任意一个：

[0007] (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0008] (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。

[0009] 本发明提供了一种Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用，Tco DNA聚合酶具有（I)、 (Π )所示的氨基酸序列中任意一个：

[0010] (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0011] (Π )具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。

[0012] 本发明提供了一种编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，其具有I、Π所示的核苷酸序列 中任意一个：

[0013] I具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0014] Π具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列；

[0015] Tco DNA聚合酶具有(Ι)、（Π)所示的氨基酸序列中任意一个：

[0016] (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0017] (Π)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。

[0018] 本发明提供了 一种重组载体，其含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子，该DNA分子具 有具有I、Π所示的核苷酸序列中任意一个：

[0019] I具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0020] Π具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列；

[0021] Tco DNA聚合酶具有(I)、（Π)所示的氨基酸序列中任意一个：

[0022] (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0023] (Π)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。

[0024] 优选地，上述的重组载体为含有T7启动子的重组载体。

[0025] 本发明提供了一种PCR扩增试剂盒，其含有Tco DNA聚合酶，该Tco DNA聚合酶具有 (I)、（ Π )所示的氨基酸序列中任意一个：

[0026] (I)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0027] (Π)具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸 获得的氨基酸序列。

[0028] 本发明还提供一种高保真DNA聚合酶的制备方法，包括以下步骤：

[0029] 获得具有编码如（I)或（Π)所限定的氨基酸序列的DNA分子；

[0030] 取上述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

[0031 ]取上述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；

[0032] 诱导上述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶；

[0033] (I)为:具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0034] (Π)为:具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基 酸获得的氨基酸序列。

[0035] 优选地，具有编码如（I)或（Π)所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为具有Ι、Π 所示的核苷酸序列中任意一个：

[0036] I具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

[0037] Π具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得 的核苷酸序列。

[0038] 优选地，获得具有编码如（I)或（Π)所限定的氨基酸序列的DNA分子，具体为从超 嗜热古菌Thermococcus coalescens中分离、重组构建出上述的DNA分子;上述的超嗜热古 菌购自日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为JCM: 12540，其分离自伊豆小笠原海沟水耀 海山的超高温海水中，为〇. 5-2μΜ的不规则球形，在指数生长期时，能融合为约5μΜ的融合细 胞;该细菌生长于57-90 °C，pH值为5.2-8.7，其最适pH值为6.5，最佳生长温度为87 °C，具有 超强嗜热生长特性；

[0039] (I)为:具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列；

[0040] (Π)为:具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基 酸获得的氨基酸序列。

[0041] 优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中所用到的宿主细胞，为原核系统宿主 细胞。

[0042] 优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中所用到的宿主细胞，为大肠杆菌宿主 细胞。

[0043] 优选地，一种高保真DNA聚合酶的制备方法中的纯化操作，具体为，采用凝胶介质 纯化。

[0044] 在本发明的一些实施例中，一种制备Tco DNA聚合酶的方法，具体为：

[0045] (1)通过同源比对Thermococcus属不同DNA聚合酶基因核苷酸序列，以相似性较高 的区段设计引物，扩增Thermococcus coalescens DNA聚合酶基因片段，再根据得到的序列 信息，不断扩增得到基因的全长序列如SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；

[0046] (2)分析上述基因结构，扩增成熟蛋白编码序列，通过重叠PCR得到如SEQ ID N0:2 所示的基因片段，构建至含T7启动子的载体上，得到重组载体；

[0047] (3)将上述重组载体转化至宿主细胞E.coli Rosetta(DE3)中，得到能生产该高保 真DNA聚合酶的转化体；

[0048] (4)扩大培养该转化体，诱导后用于制备该高保真DNA聚合酶；

[0049] (5)利用镍凝胶介质和肝素层析柱依次纯化，获得该高保真DNA聚合酶。

[0050] 本发明提供了一种高保真DNA聚合酶及其制备方法和在核酸扩增中的应用。该高 保真DNA聚合酶具有SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID N0:1所示的氨基酸序列 经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。实验数据表明，采用本发明所公 布的制备方法所制备得的高保真DNA聚合酶的纯度达95%以上，与Pfu高保真DNA聚合酶相 比，本发明提供的高保真DNA聚合酶能够扩增高GC含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模 板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA聚合酶的灵敏度和扩增 效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为 PCR扩增试剂盒中的高保真DNA聚合酶。

附图说明

[0051 ]图1示Tco DNA聚合酶的纯化结果；其中，泳道1示纯化的Tco DNA聚合酶;泳道M示 蛋白分子量Marker;

[0052] 图2示Tco DNA聚合酶扩增不同长度的核酸片段的结果；其中，泳道M示DNA分子量 Marker;泳道1示人基因组800bpP_Actin片段;泳道2示人基因组1.3kb0-globin片段;泳道3 示人基因组1.5kb0-globin片段;泳道4示人基因组3 . Okb0-globin片段;泳道5示4. IkbP-globin片段;泳道6示λ基因组Skb片段；

[0053] 图3示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增高GC含量核酸模板和含抑制剂模板的 结果;其中，1〜4示Tco DNA聚合酶扩增结果;a〜d示PfuDNA聚合酶扩增结果;泳道M示DNA分 子量Marker;泳道1示人全血237bp片段;泳道2示大肠杆菌菌液1.5kbl6srDNA片段;泳道3示 Thermus thermophilus HB8基因2kb片段;泳道4示人基因组1.5kb片段;泳道a示人全血扩 增237bp片段；泳道b示大肠杆菌菌液1 · 5kbl6srDNA片段；泳道c示Thermus thermophiIus HB8基因2kb片段;泳道d示人基因组1.5kb片段；

[0054] 图4示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增不同模板量的pUC19质粒的结果;其中 1〜5示Tco DNA聚合酶扩增结果；6〜10示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量 Marker;泳道 1 示IOng的pUC19;泳道2示Ing的pUC19;泳道3示0 · Ing的pUC19;泳道4示0 · Olng 的PUC19;泳道5示0. OOlng的pUC19;泳道6示IOng的pUC19;泳道7示Ing的pUC19 ;泳道8示 0 · Ing的pUC19;泳道9示0 · Olng的pUC19;泳道 10示0 · OOlng的pUC19;

[0055] 图5示Tco DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶扩增不同模板量的人基因组DNA的结果;其 中1〜4示Tco DNA聚合酶扩增结果；5〜8示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量 Marker;泳道1示25ng的人基因组1.3kb片段；泳道2示IOng的人基因组1.3kb片段；泳道3示 5ng的人基因组1.3kb片段；泳道4示Ing的人基因组1.3kb片段；泳道5示25ng的人基因组 1.3kb片段;泳道6示IOng的人基因组1.3kb片段;泳道7示5ng的人基因组1.3kb片段;泳道8 示Ing的人基因组1.3kb片段；

[0056] 图6示不同DNA聚合酶扩增错误率;其中1示Taq DNA聚合酶;2示Pfu DNA聚合酶;3 示Tco DNA聚合酶。

具体实施方式

[0057] 本发明公开了一种高保真DNA聚合酶，Tco DNA聚合酶，以及所述的高保真DNA聚合 酶的制备方法和在核酸扩增中的应用。本领域技术人员可以参考本文内容，获得所述的高 保真DNA聚合酶，实现其应用，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人 员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法及应用已经通过 较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文制 备方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

[0058] 本发明提供的一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用中所用到的试剂及原料均可 由市场购得。

[0059] 为了使本技术领域的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施 例，进一步阐述本发明：

[0060] 实施例1编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的获得

[0061 ] 菌种Thermococcus coalescens，购买于日本微生物菌种保藏中心，其保藏编号为 JCM: 12540。将购买的菌种以12000rpm离心5min，弃上清；细胞沉淀，参照Promega公司的 Wizard”。Genomic DNA Purification kit提取基因组DNA，其简要步骤如下：

[0062] 细胞沉淀以600yL Nuclei Lysis Solution重悬，80°C水浴5min裂解细胞;冷却至 室温后，加入200yL Protein Preciptitation Solution，震荡混勾，冰浴5min;12000rpm离 心5min;吸取上清至另一个干净的离心管，加入600yL异丙醇，混匀后冰浴IOmin; 12000rpm 离心5min;核酸沉淀以700yL70%乙醇洗涤两次，12000rpm离心5min后，弃上清，室温干燥核 酸沉淀IOmin至无酒精味，加入50yL TE溶解，即获得该菌种的基因组DNA。

[0063] 获得的Thermococcus coalescens基因组DNA未进行全基因组测序，因此无法得到 其DNA聚合酶的基因序列。通过BLAST相似性分析得到同属已测序菌种DNA聚合酶序列相似 度高的区域，设计引物调取Tco DNA聚合酶编码序列。从NCBI数据库中搜索已测序古菌DNA 聚合酶全长基因及其上下游Ikb左右核苷酸序列，使用Clustal W软件比对Thermococcus gammatolerans EJ3、Pyrococcus yayanosii CHl、Thermococcus kodakarensis KODl、 Thermococcus onnurineus NAKThermococcus sibiricus MM739序列，设计引物：

[0064] 引物BamHITcoF:具有如SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列；

[0065] 引物Tco493R:具有如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列；

[0066] 引物Tco3085F:具有如SEQIDN0:7所示的核苷酸序列；

[0067] 引物TcoDownR:具有如SEQ ID N0:8所示的核苷酸序列；

[0068] 以提取的该菌种的基因组DNA为模板，按照下列体系分别配制PCR反应液，50yL体 系中包含：上述基因组DNA50ng，引物各400nmol/L，dNTPs200ymol/L， 5 X PrimeSTAR®Biiffer(Mg2+plus)l〇yL，宝生物公司的Prim_eSTAR®HSCI5p.L。PCR 扩增程序为：98°C2min，（94°C IOs ;55°C 20s; 68°C3min)25cycles，68°C 延伸 SmiruPCR 产物电 泳检测，使用引物BamHITcoF+Tco493R扩增得到约2.5kb片段，引物Tco3085F+TcoDownR扩增 得到约3kb片段，分别回收目的条带，并分别使用Taq DNA聚合酶加A后，将所得的两个DNA分 子分别连接至PGM-T载体中，将得到阳性克隆测序确认。

[0069] 将上述测序得到的核苷酸序列，通过NCBI搜索，确认其与Thermococcus和 Pyrococcus属的编码DNA聚合酶B基因相似性最高，与Thermococcus sp.AM4DNA聚合酶B序 列相似性达到79%，说明扩增得到的是Tco DNA聚合酶的编码序列。分析其序列得知，其编码 的DNA聚合酶含有内含肽，且扩增得到的两个序列无法拼接为全长基因。

[0070] 根据测序结果、分析结果再设计引物：

[0071] 引物Tco30F:具有如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列；

[0072] 以Tco30F和TcoDownR为引物，所提取的菌种基因组DNA为模板，扩增得到约3.5kb 的片段，构建至pGM-T载体后测序，分析序列发现其中还含有内含肽。根据测序结果拼接该 3.5kb片段与由引物BamHITcoF+Tco493R扩增得到的约2.5kb的片段，得到Tco DNA聚合酶全 长基因，其全序列包含6186bp，其序列如SEQ ID N0:3所示，编码的蛋白共2061aa，其氨基酸 序列如SEQ ID NO:4所示。

[0073] 将拼接所得的基因序列与NCBI数据库中其他DNA聚合酶成熟蛋白的编码序列比对 发现，Tco DNA聚合酶基因被三个内含肽分割为四个编码框，去除内含肽后其基因包括 2328bp，编码的成熟蛋白为775aa。

[0074] 根据分析得到的Tco DNA聚合酶成熟蛋白编码序列，设计引物分别扩增四个ORF:

[0075] 引物Tcol2R:具有如SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列；

[0076] 引物Tco0RF12F:具有如SEQIDN0:ll所示的核苷酸序列；

[0077] 引物NTco0RF2R:具有如SEQIDN0:12所示的核苷酸序列；

[0078] 引物NTco0RF23F:具有如SEQIDN0:13所示的核苷酸序列；

[0079] 引物Tco0RF3R:具有如SEQIDN0:14所示的核苷酸序列；

[0080] 引物NTco0RF34F:具有如SEQIDN0:15所示的核苷酸序列；

[0081 ] 引物NotITcoWR:具有如SEQ ID NO: 16所示的核苷酸序列；

[0082] 以提取得到的菌种基因组DNA为模板，PrimeSTAR扩增不同编码框，其中BamHITcoF 和Tcol2R扩增得到约1.2kb的ORFl，Tco0RF12F和NTco0RF2R扩增得到约250bp的0RF2， NTco0RF23F 和 Tco0RF3R 扩增得到约 150bp 的 0RF3，NTco0RF34F 和 NotITcoWR 扩增得到约 700bp的0RF4。四个ORF分别连接至pGM-T载体，测序后与拼接的全长基因比对，结果显示一 一对应。

[0083] 加相同摩尔量的ORFl、2、3、4片段，以基因两端引物BamHITcoF和NotITcoWR进行重 叠PCR，拼接得到全长编码区，其序列如SEQ ID N0:2所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列如 SEQ ID N0:1所示，回收得到的全长约2.3kb片段，所得片段即为编码Tco DNA聚合酶的DNA 分子。

[0084] 实施例2含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体的构建

[0085] 将实施例1获得的全长约2.3kb的目的片段以BamH I和Not I进行酶切，连接至同 样酶切的含T7启动子的载体中，转化至DH5a感受态细胞中。

[0086] 通过菌液PCR鉴定、酶切鉴定和测序验证，证实编码Tco DNA聚合酶的基因序列的 正确性，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，所获得的质粒即为含有编码Tco DNA聚 合酶的DNA分子的重组载体。

[0087] 实施例3表达Tco DNA聚合酶融合蛋白的转化体的制备

[0088] 将实施例2获得含有编码Tco DNA聚合酶的DNA分子的重组载体转化到宿主细胞 E. col i Rosetta(DE3)中，挑取单菌落培养至OD6〇q=0.4，加入IPTG，至其浓度为0. lmmol/L诱 导4h，收集菌体超声破碎，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达，发现所制备得的转化体能够 表达Tco DNA聚合酶融合蛋白。

[0089] 实施例4Tco DNA聚合酶的制备

[0090] 将实施例3获得的能够表达Tco DNA聚合酶融合蛋白的转化体菌种，按1:100接种 至500mL含200mL LB培养基的锥形瓶中，加入卡那霉素至其终浓度为30mg/L和氯霉素至其 终浓度为34mg/L，37°C200rpm振荡培养至OD6qq=O . 4，加入IPTG至其终浓度为0. lmmol/L，于 30°(：诱导411;收集诱导后菌液，12000印111离心21^11，弃上清，细胞用2011^的？!1值为7.8， 20mmol/LTris-HCl ,0. lmol/L KCl ,50mmol/L NaCl的buffer A加30mmol/L咪卩坐重悬，于-80 °C冰箱中冻存12h; 37 °C溶解细胞，超声波破碎后于70 °C水浴锅处理30min，12000rpm离心 IOmin;上清过购买于国家生化工程技术研究中心的镍亲和介质，以含400mmol/L咪卩坐的 buffer A洗脱；洗脱液过购买于国家生化工程技术研究中心的肝素亲和介质，以含 200mmol/L、400mmol/L、600mmol/L、lmol/L NaCl的buffer A进行洗脱；收集各蛋白峰，经 SDS-PAGE检测，发现，含200mmol/L NaCl的buffer A能洗脱部分目的蛋白，含400mmol/L NaCl的buffer A大量洗脱目的蛋白，将得到的产物透析至Storage buffer:pH值为7.4， 20mmol/L Tris-HCl,0.ImmoI/L EDTA,0.l%Tween20,0.5%Nonidet P40,0.1mol/L KC1,50% 甘油。

[0091] 结果表明成功获得了Tco DNA聚合酶。SDS-PAGE显示其纯化结果如图I所示:其中， 泳道1示纯化的Tco DNA聚合酶;泳道M示蛋白分子量Marker。由图可得，所获得的Tco DNA聚 合酶的分子量约为90KDa，与其理论大小相一致，采用BandScan软件分析得其纯度达到95% 以上。

[0092] 实施例5Tco DNA聚合酶活性的测定

[0093] 将实施例4制备得的Tco DNA聚合酶以72°C30min掺入的核苷酸量确定其活性，稀 释为2.5uAxL，以荧光探针法测试其3 ’ -5 ’外切酶活性，结果显示Tco DNA聚合酶具有较强的 校正活性，说明其扩增保真性能较好。为了测试Tco DNA聚合酶的热稳定性，将酶于90°C孵 育，取0、1、2、3、4、5、6h处理的酶测DNA聚合酶活性，结果显示Tco DNA聚合酶具有极高的热 稳定性，其90°C半衰期为6h。

[0094] 实施例6Tco DNA聚合酶在核酸扩增中的应用

[0095] 将实施例4制备得的Tco DNA聚合酶应用于核酸扩增。首先，测试该Tco DNA聚合酶 在核酸扩增中的反应条件，以PUC19质粒为模板，设计引物PCR扩增约2.7kb片段确定其反应 的最适pH值及K+、NH4+、Mg2+离子浓度。配制 10 X buff er B: 500mmo 1/L Tris-HCl，pH值为7 · 4 〜8.8，15mmol/L MgCl2,分别添加不同浓度KCl、（NH4)2S〇4,反应体系为20yL，其中含：不同 条件的 10 X buf fer B2yL，2 · 5mmol/L的dNTPsl · 6yL，lOymol/L的引物PAsO · 5yL，lOymol/L的 引物PAaO · 5yL，Tco DNA聚合酶0 · 2yL，15ng/yL的pUC190 · 5yL，按98 °C 2min，（98°C IOs，60 °C 2〇8,68°02111；[11408)2505^168，最后68°(^延伸5111；[11，电泳检测，确定最适1311打61'。根据结果，确 定Tco DNA聚合酶的最适反应条件为 10 X Tco buffer :pH值为8.4,500mmol/L Tris-HCl， 150mmol/L KCl，100mmol/L(NH4)2S04，15mmol/L MgCl2o

[0096] 以所述的10 X Tco buffer和实施例4制备得的Tco DNA聚合酶分别扩增：约800bp β-Actin、1.3kb、1.5kb、3. Okb和4. lkb^-globin片段的人基因组DNA和8kb片段的λ基因组， 琼脂糖凝胶电泳结果显示均能很好地扩增得到目的片段。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2 所示，其中，泳道M示DNA分子量Marker;泳道1示人基因组800bpP_Actin片段;泳道2示人基 因组1.3kb0-globin片段;泳道3示人基因组1.5kb0-globin片段;泳道4示人基因组3. OkbP-globin片段;泳道5示4. lkbP-globin片段;泳道6示λ基因组8kb片段。

[0097] 实施例7Tco DNA聚合酶对高GC含量核酸模板和含抑制剂模板的扩增

[0098] 嗜热微生物为了适应高温环境，其基因组含有较高的GC含量，如Thermus thermophilus HB8基因组GC含量约为70%，对普通PCR反应来说这类模板的扩增存在一定困 难;而有的模板在纯化过程中容易受材料来源中抑制剂污染，导致PCR反应失败，如血液中 抗凝剂Η)ΤΑ、肝素等。

[0099] 为了测试实施例4制备得的Tco DNA聚合酶对此类复杂模板和含抑制剂模板的扩 增效果，以含EDTA的人全血为模板，直接PCR扩增237bp的S0X21非编码片段；以大肠杆菌菌 液为模板扩增16srDNA约1 ·5kb片段；以Thermus thermophilus HB8基因组为模板，扩增其 约2kb高GC片段，其GC含量约72%;以人基因组为模板，扩增其约1.5kb高GC片段，其GC含量约 为65.9%;以购买于天根生化科技(北京)有限公司的Pfu DNA聚合酶为对比例，按各自最适 条件扩增，反应完成后吸取相同量的产物电泳检测。Tco DNA聚合酶均能很好地扩增得到目 的条带，而对比例没有目的条带出现。琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示，其中，1〜4示 Tco DNA聚合酶扩增结果;a〜d示Pfu DNA聚合酶扩增结果;泳道M示DNA分子量Marker;泳道 1示人全血237bp片段；泳道2示大肠杆菌菌液I . 5kbl6srDNA片段；泳道3示Thermus thermophi Ius HB8基因2kb片段;泳道4示人基因组1.5kb片段;泳道a示人全血扩增237bp片 段;泳道b示大肠杆菌菌液1.5kbl6srDNA片段;泳道c示Thermus thermophilus HB8基因2kb 片段;泳道d示人基因组1.5kb片段。

[0100] 实施例8不同模板量条件下，Tco DNA聚合酶的扩增能力

[0101] 以PUC19质粒为模版，采用实施例4制备得的Tco DNA聚合酶扩增2.7kb的pUC19质 粒。分别以1〇1^、11^、0.1即、0.01即、0.0011^?1](：19质粒，5(^反应体系，实施例4所制备得 的Tco DNA聚合酶和购买于天根生化科技(北京)有限公司的Pfu DNA聚合酶按各自最适条 件扩增，反应完成后吸取5yL产物电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示Tco DNA聚合酶的扩 增灵敏度远高于Pfu DNA聚合酶。电泳检测结果如图4所示，其中1〜5示Tco DNA聚合酶扩增 结果；6〜10示Pfu DNA聚合酶扩增结果；泳道M示DNA分子量Marker;泳道1示IOng的pUC19 ; 泳道2示Ing的pUC19;泳道3示0 · Ing的pUC19;泳道4示0 · Olng的pUC19;泳道5示0 · OOlng的 PUC19;泳道6示IOng的pUC19;泳道7示Ing的pUC19;泳道8示0 · Ing的pUC19;泳道9示0 · Olng 的PUC19;泳道10示0 . OOlng的pUC19。由图4可观察到50yL反应体系扩增质粒模板时，Tco DNA聚合酶能检测到0 .Olng pUC19质粒，而Pfu DNA聚合酶仅在IOng的条件下能扩增该质 粒。

[0102] 实施例9不同模板量条件下，Tco DNA聚合酶的扩增能力

[0103] 以人基因组为模板，采用实施例4制备得的Tco DNA聚合酶扩增人的1.3kb片段。分 别以25即、10即、51^、11^的人基因组0嫩，5(^反应体系，实施例4所制备得的1'(3〇0嫩聚合 酶和购买于天根生化科技(北京)有限公司的Pfu DNA聚合酶按各自最适条件扩增，反应完 成后吸取5yL产物电泳检测。琼脂糖凝胶电泳结果显示Tco DNA聚合酶的扩增灵敏度远高于 Pfu DNA聚合酶。电泳检测结果如图5所示，其中1〜4示Tco DNA聚合酶扩增结果;5〜8示Pfu DNA聚合酶扩增结果;泳道M示DNA分子量Marker;泳道1示25ng的人基因组1.3kb片段;泳道2 示IOng的人基因组1.3kb片段;泳道3示5ng的人基因组1.3kb片段;泳道4示Ing的人基因组 1.3kb片段;泳道5示25ng的人基因组1.3kb片段;泳道6示IOng的人基因组1.3kb片段;泳道7 示5ng的人基因组1.3kb片段;泳道8示Ing的人基因组1.3kb片段。由图5可得Tco DNA聚合酶 能扩增低至5ng人基因组模板，而Pfu DNA聚合酶仅能在最高模板量25ng时得到微弱扩增。

[0104] 实施例IOTco DNA聚合酶保真性测试

[0105] 以蓝白斑的方法测试实施例4所制备得的Tco DNA聚合酶的保真能力，以pUC19质 粒为模板，Tco DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶分别扩增全长质粒，测定各酶 的扩增倍数。扩增倍数d，符合公式：2d=PCR产物量/起始模板量;Dpn I消化模板质粒并酶 切、连接后转化DH5a细胞，涂布含IPTG和显色底物X-Gal的平板，并计数蓝白斑。突变频率 mf，符合公式mf=白斑数/菌落总数。以公式ER=mf/(bp Xd)计算不同DNA聚合酶扩增错误率， DNA聚合酶的保真性为1/ER，错误率越低，其保真性越好。结果表明，Tco DNA聚合酶具有良 好的保真性能，其保真性为Pfu的1.8倍，Taq的9.2倍。实验结果，图6所示为三者的错误率， 其中1示Taq DNA聚合酶;2示Pfu DNA聚合酶;3示Tco DNA聚合酶。Tco DNA聚合酶的错误率 为：1.2 ΧΙΟ—6、Pfu DNA聚合酶的错误率为：2.2 ΧΙΟ—6、Taq DNA聚合酶的错误率为：10.9 X 10一6。根据DNA聚合酶的保真性为1/ER得:Tco DNA聚合酶的保真性为Pfu DNA聚合酶的1.8 倍，为Taq DNA聚合酶的9.2倍。

[0106] 由以上实施例可知，本发明所公开的一种高保真DNA聚合酶，S卩TcoDNA聚合酶，具 有扩增不同模板和片段的能力，同时对复杂模板和含抑制剂模板也能得到较好的结果，且 具有高保真扩增能力，适合各类PCR及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR扩增 试剂盒中高保真DNA聚合酶。

[0107] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对 本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改 进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1. 一种高保真DNA聚合酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

2. 如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶在核酸扩增中的应用。

3. —种编码如权利要求1所述的高保真DNA聚合酶的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序 列如SEQ ID NO:2所示。

4. 一种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求3所述的DNA分子。

5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，其为含有T7启动子的重组载体。

6. —种PCR扩增试剂盒，其特征在于，其含有高保真DNA聚合酶;所述的高保真DNA聚合 酶的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。

7. —种高保真DNA聚合酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 获得具有编码氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的DNA分子； 取所述DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体； 取所述重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体； 诱导所述转化体表达融合蛋白，经分离纯化，获得高保真DNA聚合酶。

8. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

9. 根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为原核系统宿主细胞。

10. 根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述原核系统宿主细胞为大肠杆菌。

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